一、實(shí)驗(yàn)概述及試劑準(zhǔn)備

細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)通過(guò)特異性抗體與細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)抗原結(jié)合，再利用熒光標(biāo)記的二抗進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白的可視化。這一技術(shù)在細(xì)胞結(jié)構(gòu)與

功能研究、疾病機(jī)制探索等方面具有重要應(yīng)用。

1. 抗體選擇

一抗需特異性識(shí)別目標(biāo)蛋白，熒光二抗則要與一抗來(lái)源動(dòng)物種屬相匹配。例如，如果一抗是小鼠來(lái)源，二抗需是抗小鼠的熒光抗體。

2. 固定劑與破膜劑

4% 多聚甲醛用于固定細(xì)胞，保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)。曲拉通（破膜劑）用于通透細(xì)胞膜，使抗體能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與抗原結(jié)合，但對(duì)于膜蛋白染色則可能不需要

此步驟。

3. 封閉試劑

BSA（牛血清白蛋白）或二抗來(lái)源動(dòng)物的血清（如山羊血清）用于封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，減少背景熒光。

4. 其他試劑

PBS 用于清洗細(xì)胞，DAPI 用于染細(xì)胞核，抗熒光淬滅封片劑用于封片并防止熒光淬滅，可選用含 DAPI 的封片劑簡(jiǎn)化操作。

5.玻片選擇

-貼壁細(xì)胞：可使用蓋玻片或?qū)Ｓ眉?xì)胞爬片，還有共聚焦小皿可供選擇。不同規(guī)格的共聚焦培養(yǎng)皿（如圓形的 φ24mm、φ20mm、φ14mm、φ8mm）分別對(duì)應(yīng)不

同孔板配套用細(xì)胞爬片。

-懸浮細(xì)胞：直接使用靶點(diǎn)科技懸浮細(xì)胞免疫熒光專用玻片（Biotarget）。不要再用傳統(tǒng)的方法，否則掉片不可避免。

二、細(xì)胞爬片準(zhǔn)備及操作

1.爬片處理（非共聚焦小皿）

將剪裁好的爬片或購(gòu)買的成品爬片，置于濃硫酸中浸泡過(guò)夜，然后用自來(lái)水沖洗干凈。接著將其置于消毒飯盒中，飯盒底面放紗布，玻片斜靠在飯盒側(cè)

壁且正面不接觸紗布，進(jìn)行高壓蒸汽滅菌后烘干。

對(duì)于原代細(xì)胞或貼壁不牢的細(xì)胞，爬片前最好用多聚賴氨酸、層粘蛋白或膠原溶液處理玻片以增加細(xì)胞粘附性，處理后用培養(yǎng)基沖洗 1 - 3 遍再放入培

養(yǎng)基中。

2.共聚焦小皿

無(wú)需前處理操作，直接在超凈臺(tái)打開包裝，加入細(xì)胞懸液，蓋上皿蓋，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)即可。

三、實(shí)驗(yàn)操作

1.細(xì)胞接種準(zhǔn)備

胰酶消化細(xì)胞后計(jì)數(shù)，重懸細(xì)胞于培養(yǎng)基中。根據(jù)玻片大小，在每個(gè)孔里放爬片的位置先滴 100ul 培養(yǎng)基，使玻片與培養(yǎng)皿靠培養(yǎng)基張力粘合，然后放

玻片，防止加細(xì)胞懸液時(shí)玻片漂起。

2.細(xì)胞接種

根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要及細(xì)胞生長(zhǎng)情況選擇合適的細(xì)胞密度接入培養(yǎng)板內(nèi)。待細(xì)胞貼壁后，可去上清加含藥培養(yǎng)基。

3.玻片取出

按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，作用一定時(shí)間后取玻片（通常作用 24h）。取玻片時(shí)，可將注射器針頭針尖向背面弄個(gè)小鉤，輕輕勾起爬片，用小鑷子取出。對(duì)于多時(shí)

間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，取出所需數(shù)量的爬片時(shí)應(yīng)用酒精燈火焰燒一下針頭和鑷子，未取出的可接著繼續(xù)培養(yǎng)。

四、固定、通透及封閉步驟

1.清洗與固定方式

可以將爬片取出用 PBS 清洗后固定，也可以直接在孔板中清洗并固定。共聚焦小皿則直接移除培養(yǎng)基，加入 PBS 清洗 1 - 3 次（不可劇烈搖晃），然后

加入 4% 多聚甲醛進(jìn)行固定，通常在室溫（RT）固定 15 - 20min。

2.通透及封閉劑選擇與作用條件

如果抗體針對(duì)胞內(nèi)蛋白，則需要通透步驟。常用的透化劑是 0.1% Triton X - 100（將 100% 的成品用 PBS 稀釋），作用 10min，但文獻(xiàn)中也有用 0.2% 或 0.5% Triton X - 100 的，具體可根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行調(diào)整。

BSA 濃度為 1% 或 5%（用 PBS 溶解），血清濃度為 10%，在室溫（RT）封閉 30min。如果一抗結(jié)合力很強(qiáng)或二抗有非特異性結(jié)合，可添加 0.1% Tween20。

五、抗體孵育及染色封片

1.一抗稀釋與孵育條件

封閉結(jié)束后，用 PBS 清洗 3 遍，然后孵育一抗。一抗可用封閉液稀釋，也可以用 PBS 或抗體稀釋液，在 4℃孵育過(guò)夜。一抗稀釋比例可參照抗體說(shuō)明書，建議從推薦比例中間開始試。

2.二抗孵育操作

次日吸走一抗（可回收）后，用 PBST 清洗 3 遍，每次 5 - 10min，然后避光孵育二抗 1h。

3.DAPI 染色操作

去除二抗，用 PBS 清洗三次，加入 DAPI，室溫靜置 5min，去除 DAPI，再用 PBS 洗 3 次。

4.封片操作

向載玻片上加入一滴封片劑，將蓋玻片緩慢扣在載玻片上，細(xì)胞所在面靠近載玻片，用吸水紙吸除多余封片劑。

免疫熒光，其實(shí)各種Protocol大同小異，核心除了多聯(lián)系，還要多思考。弄懂背后的邏輯。不能機(jī)械的做。